MÉTHODES DE CULTURE DE MICRO-ORGANISMES. ÉTUDE DE CULTURE ET BIOCHIMIE
PROPRIÉTÉS
La culture, c'est-à-dire la culture de micro-organismes en laboratoire, permet d'étudier leurs propriétés et d'obtenir de la biomasse. Les bactéries, les champignons, les actinomycètes, les spirochètes et certains protozoaires sont cultivés sur des milieux nutritifs. Chlamydia, rickettsia, virus et certains protozoaires ne peuvent se reproduire que dans le corps d'un animal ou dans des cellules vivantes.
Les propriétés culturelles de ce type de micro-organismes sont : 1) les conditions nécessaires à la reproduction, et 2) la nature de la croissance sur les milieux nutritifs. Les biens culturels sont l'une des caractéristiques qui sont prises en compte lors de l'identification (détermination du type) de micro-organismes.
Média culturel
Les milieux de culture doivent répondre à certaines exigences. Ils doivent contenir tous les nutriments nécessaires à la reproduction de ce type de microbes. Certains micro-organismes pathogènes se développent sur des milieux nutritifs simples, tandis que d'autres ont besoin d'un apport de sang, de sérum sanguin et de vitamines pour leur reproduction.
Dans les milieux de culture, certaines conditions doivent être créées en ajoutant du chlorure de sodium ou des solutions tampons. Pour la plupart des bactéries, un milieu nutritif contenant 0,5% de chlorure de sodium est favorable. La réaction du milieu nutritif, favorable à la plupart des bactéries pathogènes, est légèrement alcaline, ce qui correspond à pH = 7,2-7,4. Vibrio cholerae pousse à pH = 7,8-8,5, les champignons - à pH = 5-5,5. Les milieux de culture doivent être humides, c'est-à-dire contenir une quantité d'eau suffisante, être aussi transparents et stériles que possible, c'est-à-dire, avant le semis, ne pas contenir de microbes.
En termes de composition et d'origine, les milieux nutritifs sont naturels, artificiels et synthétiques. Les milieux de culture naturels sont des produits naturels tels que les pommes de terre et autres légumes. Les milieux nutritifs artificiels sont préparés selon une recette spécifique à partir de produits additionnés de composés organiques et inorganiques. Les supports synthétiques contiennent certains composés chimiques à des concentrations connues.
Par consistance, les milieux nutritifs sont liquides, semi-liquides, denses. L'agar-agar-polysaccharide isolé des algues est généralement utilisé comme scellant. L'agar-agar n'est pas utilisé par les micro-organismes comme nutriment ; il forme un gel dans l'eau qui fond à 100°C et se solidifie à 45°C.
Pour obtenir un milieu nutritif dense, de l'agar-agar est ajouté à une concentration de 1,5 à 2%, pour le semi-liquide à 0,5%.
Selon leur destination, les milieux de culture peuvent être divisés en diagnostics ordinaires (simples), spéciaux, électifs et différentiels.
Les milieux nutritifs conventionnels (simples) sont utilisés pour la culture de la plupart des micro-organismes, il s'agit du bouillon mésopatamique (MPB), de la gélose mésopatamique (MPA).
Des milieux nutritifs spéciaux sont utilisés pour la culture de micro-organismes qui ne poussent pas sur des milieux simples. Par exemple, gélose au sang et bouillon de sucre pour le streptocoque, gélose au sérum pour le méningocoque et le gonocoque.
Les milieux de culture électifs sont utilisés pour isoler une espèce à partir d'un mélange de différentes bactéries. Ce type de bactéries se développe sur cet environnement plus rapidement et mieux que d'autres, les dépassant dans sa croissance ; la croissance des autres bactéries est retardée sur ce milieu. Par exemple, le sérum coagulé pour le bacille diphtérique, l'eau peptonée alcaline pour le vibrion cholérique, le bouillon biliaire pour le bacille typhoïde, les milieux salins pour le staphylocoque.
Les milieux de culture de diagnostic différentiel permettent de distinguer certains types de bactéries des autres par leur activité enzymatique (voir la rubrique correspondante).
Culture et isolement de cultures pures de bactéries aérobies
Pour la culture de micro-organismes, certaines conditions sont nécessaires : température, conditions aérobies ou anaérobies.
La température doit être optimale pour l'espèce. La plupart des bactéries pathogènes se développent à 37°C. Cependant, pour certaines espèces, une température plus basse est optimale, ce qui est associé aux particularités de leur écologie. Ainsi, pour le bacille de la peste, dont l'habitat naturel est le rongeur pendant l'hibernation, la température optimale est de 28°C, ainsi que pour le leptospira, pour le bacille du botulisme - 28°C-35°C.
En plus de la température optimale, pour la culture des micro-organismes, selon les espèces, un environnement aérobie ou anaérobie est requis.
Afin d'étudier la morphologie, les propriétés culturelles, biochimiques et autres des microbes, il est nécessaire d'obtenir une culture pure. Habituellement, une culture de microbes est appelée leur accumulation sur un milieu nutritif sous forme de turbidité, de croissance proche du fond (paroi), ou d'un film à la surface d'un milieu liquide ou de colonies sur un milieu dense. Une seule colonie est formée à partir d'une cellule microbienne. Une culture pure est une culture de microbes de la même espèce obtenue à partir d'une seule colonie. Dans les laboratoires, certaines souches connues de microbes sont utilisées pour diverses études. Une souche est une culture pure de microbes obtenus à partir d'une source spécifique, à un moment précis, avec des propriétés connues. Typiquement, les souches microbiennes sont désignées par un numéro spécifique. Par exemple, la souche Staphylococcus aureus 209P est utilisée pour déterminer l'activité de la pénicilline.
L'isolement de cultures pures d'aérobies prend généralement trois jours et s'effectue selon le schéma suivant :
1er jour - microscopie d'un frottis du matériel de test, coloré (généralement par Gram) - pour une connaissance préliminaire de la microflore, qui peut être utile pour choisir un milieu de culture pour l'inoculation. Puis ensemencement du matériel sur la surface de la gélose nutritive congelée pour obtenir des colonies isolées. Le tamisage peut être effectué selon la méthode Drygalsky dans trois boîtes de Pétri avec un milieu nutritif. Une goutte de matière est appliquée sur le premier gobelet et étalée à la spatule sur l'ensemble du gobelet. Ensuite, avec la même spatule, répartissez le reste de culture dessus sur la deuxième tasse et de la même manière sur la troisième. Le plus grand nombre de colonies se développera sur la première plaque, le moins sur la troisième. Des colonies isolées se développeront sur l'une des plaques, en fonction du nombre de cellules microbiennes présentes dans le matériel d'essai.
Le même résultat peut être obtenu en tamisant sur une tasse. Pour ce faire, divisez la tasse en quatre secteurs. Le matériel à l'étude est ensemencé avec une anse bactériologique avec des coups sur le premier secteur, puis, après avoir calciné et refroidi l'anse, l'inoculation est répartie du premier secteur au deuxième et de la même manière séquentiellement dans les troisième et quatrième secteurs. Des colonies isolées sont formées à partir de cellules microbiennes individuelles après 24 h d'incubation dans un thermostat.
2ème jour - étude des colonies cultivées sur plaques, description de celles-ci. Les colonies peuvent être transparentes, translucides ou opaques, elles ont des tailles différentes, des contours arrondis réguliers ou irréguliers, une forme convexe ou plate, une surface lisse ou rugueuse, lisse ou ondulée, des bords déchiquetés. Ils peuvent être incolores ou blancs, dorés, rouges, jaunes. Sur la base de l'étude de ces caractéristiques, les colonies cultivées sont divisées en groupes. Ensuite, une colonie isolée est sélectionnée dans le groupe d'étude, un frottis est préparé pour un examen microscopique afin de vérifier l'homogénéité des microbes dans la colonie. La même colonie est inoculée dans un tube à essai avec une gélose nutritive inclinée.
3ème jour - vérification de la pureté de la culture cultivée sur gélose inclinée par microscopie de frottis. Avec l'homogénéité des bactéries étudiées, l'isolement d'une culture pure peut être considéré comme complet.
Pour identifier les bactéries isolées, des traits culturels sont étudiés, c'est-à-dire la nature de la croissance sur des milieux nutritifs liquides et solides. Par exemple, les streptocoques sur le bouillon de sucre forment un sédiment de fond et pariétal, sur de la gélose au sang - de petites colonies ponctuelles; le vibrion cholérique forme un film à la surface de l'eau peptonée alcaline et des colonies transparentes sur la gélose alcaline ; le bacille de la peste sur gélose nutritive forme des colonies sous forme de "mouchoirs en dentelle" avec un centre dense et des bords ondulés minces, et dans un milieu nutritif liquide - un film à la surface, puis - des fils s'étendant de celui-ci sous la forme de " stalactites".
Culture et isolement de cultures pures de bactéries anaérobies
Pour la culture des anaérobies, il est nécessaire d'abaisser le potentiel d'oxydoréduction du milieu, de créer une anaérobiose en éliminant l'oxygène par des méthodes physiques, chimiques ou biologiques.
Les méthodes physiques comprennent :
1) élimination mécanique de l'air au moyen d'une pompe de l'anae-rostat, dans laquelle des boîtes avec des inoculations sont placées. En même temps, vous pouvez remplacer l'air par un gaz indifférent : azote, hydrogène, dioxyde de carbone.
2) croissance dans un milieu contenant des substances réductrices. Kitta-Tarozzi mercredi est un bouillon de sucre avec des morceaux de foie ou de viande. Le glucose et les morceaux d'organes ont une capacité réductrice. Le milieu est versé sur le dessus avec une couche d'huile de vaseline pour bloquer l'accès de l'oxygène de l'air.
3) La méthode la plus simple, mais la moins fiable, consiste à cultiver profondément dans une haute colonne de gélose au sucre.
Les méthodes chimiques consistent dans le fait que des plats contenant des cultures d'anaérobies sont placés dans un dessiccateur hermétiquement fermé, où sont placés des produits chimiques, par exemple du pyrogallol et des alcalis, dont la réaction se déroule avec l'absorption d'oxygène.
La méthode biologique est basée sur la culture simultanée d'anaérobies et d'aérobies sur des milieux nutritifs solides dans des boîtes de Pétri, hermétiquement fermées après inoculation. Au début, l'oxygène est absorbé par les aérobies en croissance, puis la croissance des anaérobies commence.
L'isolement d'une culture pure d'anaérobies commence par l'accumulation de bactéries anaérobies par inoculation sur milieu Kitta-Tarozzi. À l'avenir, les colonies isolées sont obtenues de l'une des deux manières suivantes :
1) le matériel est ensemencé par mélange avec de la gélose au sucre chaud fondu dans des tubes en verre. Après solidification de la gélose, des colonies isolées se développent dans ses profondeurs, qui sont prélevées en coupant le tube et repiquées sur milieu Kitt-Tarozzi (méthode de Weinberg) ;
2) l'ensemencement du matériel est réalisé sur des plaques avec un milieu nutritif et incubé en anaérostat. Les colonies isolées cultivées sur plaque sont repiquées sur milieu Kitt-Tarozzi (méthode Zeissler).
Culture d'autres micro-organismes
Culture de mycoplasmes
Les mycoplasmes sont cultivés sur des milieux nutritifs additionnés de sérum et de glucides. Comme les mycoplasmes n'ont pas de paroi cellulaire, ils ne se développent que dans des environnements isotoniques ou hypertoniques. Sur des milieux nutritifs solides, pendant plusieurs jours, de très petites colonies se forment, ressemblant à des œufs au plat - avec un centre convexe et une périphérie plate translucide. Les mycoplasmes peuvent également être cultivés dans des embryons de poulet ou en culture cellulaire.
Culture de rickettsia et de chlamydia
Les rickettsies et les chlamydias sont des parasites intracellulaires obligatoires. Pour leur culture, des cultures cellulaires, des embryons de poulet et des infections animales sont utilisés.
Culture de champignons
Pour la culture des champignons, des milieux nutritifs denses et liquides sont utilisés : le plus souvent le milieu de Sabouraud, ainsi que les milieux contenant du moût de bière. Les champignons poussent plus lentement que les bactéries, ils forment une croissance visible en quelques jours. La température de culture est inférieure à celle des bactéries - 22-30 ° C.
Culture de spirochètes et de protozoaires
Parmi les spirochètes, il est le plus facile de cultiver des leptospira, pour lesquels l'eau mélangée à du sérum sanguin de lapin peut servir de milieu nutritif.Borrelia et Treponema sont cultivés dans des conditions anaérobies sur des milieux nutritifs plus complexes contenant du sérum, des morceaux de tissus animaux.
Parmi les protozoaires, la dysenterie amibe, lamblia, Trichomonas, leishmania, trypanosome, balantidia sont cultivés sur des milieux nutritifs.Toxoplasma est cultivé sur des embryons de poulet et des cultures tissulaires. Des méthodes de culture des plasmodes du paludisme sont en cours de développement.
Méthodes d'étude de l'activité enzymatique (propriétés biochimiques)
Dans la pratique microbiologique, l'étude de l'activité enzymatique est utilisée pour identifier les micro-organismes, car chaque espèce microbienne possède un certain ensemble d'enzymes.
Pour déterminer l'activité protéolytique, les microbes sont inoculés avec une injection dans une colonne de gélatine, et après 3 à 5 jours d'incubation à température ambiante, le caractère de liquéfaction de la gélatine est noté : sous forme d'entonnoir, d'ongle, de bas ou sous la forme d'un sapin de Noël renversé. L'activité protéolytique est également déterminée par la formation de produits de décomposition des protéines : indole, sulfure d'hydrogène, ammoniac. Pour les déterminer, des micro-organismes sont ensemencés dans un bouillon de viande-peptone, et des papiers indicateurs sont placés entre le col du tube à essai et un bouchon en coton, en excluant leur contact avec le milieu. Lorsque l'indole se forme, le papier imprégné d'une solution saturée d'acide oxalique devient rose ; en présence d'hydrogène sulfuré, le papier imprégné d'acétate de plomb noircit ; lorsque l'ammoniac se forme, le papier de tournesol rouge devient bleu.
Pour déterminer les propriétés saccharolytiques des microbes, des milieux de diagnostic différentiel sont utilisés, tels que les milieux de Giss, le milieu d'Olkénitsky, le milieu d'Endo, le milieu de Levin, le milieu de Ploskirev.
Les médias Endo, Levin, Ploskirev dans les boîtes de Pétri sont utilisés pour différencier les bactéries du groupe intestinal par leur capacité à fermenter le lactose. Ces milieux contiennent de la gélose nutritive, du lactose et un indicateur qui change de couleur dans un milieu acide - un indicateur de pH. Si des bactéries qui fermentent le lactose, telles que E. coli, sont semées dans un tel environnement, de l'acide se forme à la suite de la fermentation du lactose et l'indicateur changera de couleur dans un environnement acide. Ainsi, les colonies d'Escherichia coli sur ces milieux seront colorées selon la couleur de l'indicateur : sur milieu d'Endo et de Ploskirev - en rouge, sur milieu de Levin - en noir et bleu. Les colonies de bactéries qui ne fermentent pas le lactose, comme les bâtonnets de salmonelle et de dysenterie, seront incolores.
Les milieux Giss (milieu « panaché ») sont préparés à base d'eau peptonée ou de gélose viande-peptone semi-liquide. Contient un glucide ou un alcool polyhydrique et un indicateur. Lorsqu'un microbe se développe sur le milieu de Giss, fermentant ce substrat avec formation d'acide et de gaz, le milieu va changer de couleur, en milieu semi-liquide, des bulles et des ruptures apparaissent dans l'épaisseur de la gélose, en milieu liquide - un gaz bulle dans un flotteur en verre. Lorsque le substrat est fermenté uniquement en acide, il n'y a qu'un changement de couleur du milieu.
Des milieux combinés ne contenant pas un glucide, mais deux ou trois sont également utilisés, par exemple le milieu d'Olkénitsky. Un tube de ce milieu remplace les milieux gélosés et Giss par du lactose, du glucose et du saccharose. Après stérilisation à l'état fondu, le milieu dans l'éprouvette est biseauté de manière à obtenir une colonne et une partie biseautée. Le semis se fait par un trait le long de la partie biseautée et une piqûre dans une colonne. Lorsque le lactose ou le saccharose sont fermentés, la couleur de l'ensemble du milieu change ; lorsque le glucose seul est fermenté, seule la couleur de la colonne change. La formation de gaz est indiquée par la présence de bulles dans la colonne d'agar. Lorsque les microbes libèrent de l'ammoniac, la couleur du milieu ne change pas. La formation de sulfure d'hydrogène se manifeste par un noircissement dans la table de gélose
Pour la méthode express de détermination de l'activité enzymatique des bactéries, des systèmes de microtest et un système de papier indicateur (NIB) sont utilisés
Le système de microtest est un récipient en polystyrène transparent, composé de plusieurs cellules. Les cellules contiennent des milieux nutritifs séchés avec des glucides et des indicateurs de pH. Une suspension d'une culture de bactéries d'une certaine densité est inoculée dans chaque cellule. Une solution saline est versée dans les cellules de contrôle.
indicateur
Les systèmes de papier indicateur (NIB) pour l'identification de la famille des entérobactéries sont des disques ou des bandes de papier chromatographique, recouverts d'un film protecteur et contenant un substrat spécifique et un indicateur en changeant la couleur de l'indicateur Pour déterminer le sulfure d'hydrogène, le disque est placé à la surface de l'AMP, ensemencé avec une injection, ce qui permet de déterminer simultanément la mobilité
Dans tous les tubes, le résultat préliminaire du même jour et le résultat final du lendemain sont pris en compte.
L'activité oxydase est déterminée en frottant la culture sur un papier indicateur, le résultat est pris en compte au bout d'une minute.
TISSU ISOLÉ ET CELLULES VÉGÉTALES
Culture de cellules et de tissus isolés sur des milieux nutritifs artificiels dans des conditions stériles (in vitro) reçu le nom de la méthode de culture de tissus isolés.
Du fait que les plantes à graines sont de la plus grande importance dans la vie humaine, les méthodes et les conditions de leur culture ont été mieux développées que pour les gymnospermes ou les algues, dont la culture dans des conditions stériles pose certaines difficultés. Cependant, indépendamment de l'appartenance des plantes à un groupe taxonomique particulier, il existe des exigences générales pour la culture d'objets en culture. in vitro.
Asepsie. Tout d'abord, la culture de fragments de tissus ou d'organes végétaux - explants, et plus encore de cellules individuelles, nécessite une asepsie complète. Les micro-organismes qui peuvent pénétrer dans le milieu nutritif libèrent des toxines qui inhibent la croissance cellulaire et entraînent la mort de la culture. Par conséquent, pour toutes les manipulations avec les cellules et les tissus pendant la culturein vitro respecter certaines règles d'asepsie dans une boîte laminaire ou dans des chambres aseptiques. Dans le premier cas, l'asepsie est réalisée en fournissant de l'air stérile filtré dirigé de la boîte laminaire à l'extérieur vers le travailleur. Les salles aseptiques sont stérilisées à l'aide de lampes ultraviolettes et travaillent dans ces salles avec des vêtements stériles. La surface de travail des tables dans les salles aseptiques et les outils sont en outre stérilisés à l'alcool avant le travail.
La vaisselle propre préalablement emballée dans du papier ou du papier d'aluminium, les outils, le papier, le coton sont stérilisés par chaleur sèche dans une étuve à 160 ° C pendant 1,5 à 2 heures.Les milieux de culture sont stérilisés dans un autoclave à 120 ° C et à haute pression dans les 15 - 20 minutes. Si les milieux de culture contiennent des substances qui se décomposent lors de l'autoclavage, ils doivent être stérilisés par filtration sur filtre bactérien. Ensuite, les composants filtrés stériles sont ajoutés à un milieu pré-autoclavé refroidi à une température de 40°C.
Les tissus végétaux eux-mêmes peuvent constituer une source sérieuse d'infection, car la microflore épiphyte est toujours située à leur surface. Par conséquent, une stérilisation de surface est nécessaire, qui est effectuée comme suit. Auparavant, la partie de la plante dont l'explant sera extrait est lavée à l'eau et au savon et rincée à l'eau claire. Ensuite, le matériel végétal est stérilisé dans des solutions de désinfectants. Certaines de ces substances, ainsi que le temps de stérilisation sont présentés dans le tableau. 6.1.
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Tableau 6.1 Stérilisation du matériel végétal d'origine (selon R.G.Butenko, 1999) Un objet |
Temps de stérilisation, min |
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diacide 0,1% |
chlorure mercurique 0,1% |
peroxyde d'hydrogène, 10-12% |
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Les graines sont sèches |
15-20 |
10-15 |
12-15 |
|
Les graines sont gonflées |
6-10 |
6-8 |
6-8 |
|
Tissu de tige |
20-40 |
20-25 |
— |
|
Feuilles |
1-3 |
0,5-3 |
‘ 3-5 |
|
Apex |
1-10 |
0,5-7 |
2-7 |
Après avoir conservé les explants dans une solution désinfectante, ils sont lavés plusieurs fois dans de l'eau distillée et la couche externe de cellules sur les tranches des explants est retirée au scalpel, car elle peut être endommagée lors de la stérilisation.
Des micro-organismes peuvent également être trouvés à l'intérieur des tissus végétaux. L'infection interne est plus fréquente chez les plantes tropicales et subtropicales. Par conséquent, en plus de la stérilisation de surface, il est parfois nécessaire d'utiliser des antibiotiques, qui tuent la flore microbienne à l'intérieur du tissu. Cependant, il est à noter qu'un tel traitement ne conduit pas toujours à une stérilisation des tissus internes, car il est difficile de choisir un antibiotique ciblé.
Média culturel. Les cellules et les tissus isolés sont cultivés sur des milieux nutritifs à plusieurs composants. Ils peuvent différer considérablement dans leur composition, cependant, la composition de tous les milieux comprend nécessairement des macro- et micro-éléments nécessaires aux plantes, glucides, vitamines, phytohormones et leurs analogues synthétiques. Les glucides (généralement du saccharose ou du glucose) sont inclus dans toute formule nutritionnelle à une concentration de 2 à 3 %. Ils sont nécessaires en tant que composant nutritionnel, car la plupart des tissus calleux manquent de chlorophylle et ne sont pas capables d'une nutrition autotrophe. Par conséquent, ils sont cultivés dans des conditions d'éclairage diffus ou dans l'obscurité. L'exception est le tissu calleux de la mandragore, de l'amarante et de certaines autres plantes.
Les composants essentiels des milieux de culture doivent être les ^ auxines, qui provoquent la dédifférenciation des cellules d'explant, et les cytokinines, qui induisent la division cellulaire. Lorsque le rapport entre ces phytohormones change ou lorsque d'autres phytohormones sont ajoutées, différents types de morphogenèse peuvent être provoqués.
La teneur élevée en nitrates, ions ammonium, potassium, phosphate favorise une croissance cellulaire rapide. L'appauvrissement de l'environnement réduit considérablement la croissance et les processus du métabolisme secondaire. Cependant, la teneur initialement faible en phosphates dans le milieu nutritif peut stimuler la synthèse de métabolites secondaires. Il a été constaté que la culture de cals de réglisse sur un milieu avec la moitié de la concentration d'azote et de phosphore dans l'obscurité augmente la teneur en composés phénoliques de 1,6 fois par rapport aux cals cultivés sur un milieu complet. L'endosperme d'embryons immatures (coco, marronnier d'Inde, etc.), la sève de certains arbres, divers extraits (malt, levure, jus de tomate) peuvent être ajoutés au milieu. Les présenter à l'environnement. do donne des résultats intéressants, mais de telles expériences sont difficiles à reproduire, car le principe actif n'est généralement pas connu exactement. Par exemple, l'ajout de fractions séparées de lait de coco au milieu nutritif n'a donné aucun résultat, tandis que l'endosperme non fractionné a provoqué la division cellulaire.
Lors de la préparation de milieux nutritifs solides pour la culture en surface de tissus calleux, on utilise de l'agar-agar purifié, un polysaccharide obtenu à partir d'algues. Comme exemples dans le tableau. 6.2 montre les compositions des milieux de culture les plus courants.
L'environnement de Murashige et Skoog est le plus polyvalent. Il convient à la formation de cals, au maintien d'une croissance désorganisée des cals et à l'induction de la morphogenèse chez la plupart des plantes dicotylédones. Ainsi, une modification du rapport de l'auxine et de la kinétine conduit à la formation soit de racines (prédominance de l'auxine), soit ; plantes à tiges (prédominance de la kinétine).
Le milieu Gamborg et Eveleg est bien adapté à la culture de cellules et de tissus de légumineuses et de céréales, le milieu de White assure * l'enracinement des pousses et une croissance normale de la tige après régénération, et le milieu Nitsch et Nitsch est adapté à l'induction d'andro-jegenèse dans la culture des anthères.
Facteurs physiques. Pour la croissance et le développement des tissus végétaux; in vitro les facteurs physiques - la lumière, ont une grande influence; température, aération, humidité. |
Léger. La plupart des tissus calleux peuvent se développer dans des conditions de faible luminosité ou d'obscurité, car ils ne sont pas capables de photographier * ; synthétiser.Dans le même temps, la lumière peut agir comme un facteur de morphogenèse et d'activation des processus pour la deuxième fois.
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!Composition des milieux nutritifs utilisés dans la culture des cellules et des tissus (d'après R.G.Butenko, 1999) |
Concentration des milieux de culture, mg/l |
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Composant média |
Murashige et |
Gamborg et |
Blanche, |
Nich et Nich, |
|
Skoog, 1962 |
Evelega, 1968 |
1939 |
1974-1975 |
|
|
KN03 |
1900 |
3000 |
81 |
950 |
|
NH4NO3 |
1650 |
— |
— |
720 |
|
Ca (N03)2 |
— |
— |
142 |
— |
|
Ca (N03)2-4H20 |
— |
— |
— |
— |
|
(NH4)2S04 |
— |
134 |
— |
— |
|
MgS04-7H20 |
370 |
500 |
74 |
185 |
|
CaCl2H20 |
— |
— |
166 |
|
|
CaClr2H20 |
440 |
150 |
— |
— |
|
KC1 |
— |
65 |
— |
|
|
KH2P04 |
170 |
— |
12 |
68 |
|
NaH2P04H20 |
— |
150 |
— |
— |
|
MnS04H20 |
— |
10 |
— |
— |
|
MnS0 „-4H20 |
22,3 |
— |
— |
25 |
|
ZnS04-4H20 |
8,6 |
— |
— |
— |
|
ZnS04-7H20 |
— |
2 |
— |
10 |
|
H3B04 |
6,2 |
3 |
— |
10 |
|
CuS04-5H20 |
0,025 |
0,075 |
— |
0,025 |
|
N / A2Mo04-2H20 |
0,25 |
0,25 |
— |
0,25 |
|
CoCl2-6H20 |
0,025 |
— |
— |
— |
|
FeS04-7H20 |
27,8 |
— |
— |
27,8 |
|
Na EDTA-2H20 |
37,3 |
— |
— |
37,3 |
|
Séquestrène 330-Fe |
28 |
— |
— |
|
|
Mésoinosite |
100 |
— |
— |
200 |
|
Acide ascorbique |
— |
— |
— |
3 |
|
Thiamine-HCl |
0,5 |
— |
— |
3 |
|
Pyridoxine-HCl |
0,5 |
— |
— |
1 |
|
Un acide nicotinique |
0,5 |
— |
— |
— |
|
Saccharose |
30 000 |
20000 |
2000 |
60 000 |
|
Gélose "Difco", gel |
— |
— |
— |
7000 |
|
rith, agarose |
||||
e synthèse. Les lampes fluorescentes sont utilisées comme source de lumière. Pour la plupart des plantes herbacées, l'éclairement optimal est d'environ 1000 lux. Un éclairage trop faible (300 lux) ou élevé (3000 à 10 000 lux) inhibe la croissance. L'éclairage peut affecter le métabolisme des cellules calleuses. Ainsi, dans les cultures de théier, la biosynthèse des polyphénols augmente sous l'influence de la lumière. Au contraire, en culture cellulaire Scopolia parviflora la lumière a supprimé la formation d'alcaloïdes. En plus de l'intensité de l'éclairage, la qualité de la lumière affecte la culture tissulaire et ses caractéristiques physiologiques. Ainsi, plus de 20 flavones et glycosides de flavonol se forment dans les cultures cellulaires de persil après illumination de celle-ci avec une lumière luminescente continue "blanc froid". Dans le même temps, la synthèse des glycosides de flavones est activée par irradiations successives à la lumière ultraviolette, puis par lumière située dans la région du "rouge-rouge à ondes longues"
Température. Pour la plupart des cultures de cals, la température optimale est de 26°C. Dans le même temps, les cultures de cals et de cellules de Dioscorea deltoid se développent bien même à une température de 32 ° C. DANS Contrairement à la croissance des cultures cellulaires et tissulaires, l'induction de leur morphogenèse nécessite des températures plus basses (18 - 20°C). Effet de la température sur le métabolisme cellulaire in vitro mal étudié. Il est prouvé que dans les cultures de cals, la formation maximale d'alcaloïdes a été observée à une température de 25 ° C et qu'avec une augmentation de la température, elle a fortement diminué. En cultures cellulaires en suspension Ipomée la teneur en acides gras augmentait de manière significative s'ils étaient cultivés à des températures de croissance sous-optimales (15 ° C) Par conséquent, lors de la croissance d'une culture in vitro il est nécessaire d'étudier attentivement l'influence de tous les facteurs abiotiques, y compris la température, sur la croissance et le métabolisme des cellules.
Aération. Pour la culture des cultures en suspension, l'aération est d'une grande importance. Il est particulièrement important d'alimenter les cellules cultivées en air dans de grands volumes de fermenteurs.
En comparant différents types de fermenteurs, il a été montré que la synthèse de métabolites secondaires en culture en suspension était la plus élevée lorsque l'air était fourni par le bas. Lors de la culture de cellules en petits volumes (dans des flacons), une aération normale est obtenue avec une agitation constante de la suspension.
Humidité. L'humidité optimale dans la pièce où je cultive!Les cultures doivent être de 60 à 70%.
Ainsi, la culture des cellules et des tissus dépend de nombreux facteurs de l'environnement extérieur, et leur action n'est-elle pas toujours bonne ? stno. Par conséquent, lors de l'introduction d'une nouvelle espèce végétale en culture, il est nécessaireT Tout d'abord, il est nécessaire d'étudier attentivement l'influence des facteurs physiques sur la croissance et les caractéristiques physiologiques de cette culture.
La culture de cellules et de tissus isolés sur des milieux nutritifs artificiels dans des conditions stériles (in vitro) est appelée méthode de culture de tissus isolés.
Du fait que les plantes à graines sont de la plus haute importance dans la vie humaine, les méthodes et les conditions de leur culture sont mieux développées que pour les gymnospermes ou les algues, dont la culture dans des conditions stériles pose certaines difficultés. Cependant, indépendamment de l'appartenance des plantes à un groupe taxonomique particulier, il existe des exigences générales pour la culture d'objets en culture in vitro.
Asepsie. Tout d'abord, la culture de fragments de tissu ou d'organe d'une plante - explants, et plus encore pour les cellules individuelles, nécessite une asepsie complète.Les micro-organismes pouvant pénétrer dans le milieu nutritif libèrent des toxines qui inhibent la croissance cellulaire et entraînent la mort de la culture. Par conséquent, lors de toutes les manipulations avec les cellules et les tissus lors de la culture in vitro, certaines règles d'asepsie sont respectées.
Média culturel. Les cellules et les tissus isolés sont cultivés sur des milieux nutritifs à plusieurs composants. Ils peuvent différer considérablement dans leur composition, cependant, la composition de tous les milieux comprend nécessairement des macro- et micro-éléments nécessaires aux plantes, glucides, vitamines, phytohormones et leurs analogues synthétiques. Les glucides (généralement du saccharose ou du glucose) sont inclus dans tout mélange de nutriments à une concentration de 2 à 3 %. Ils sont nécessaires en tant que composant nutritionnel, car la plupart des tissus calleux manquent de chlorophylle et ne sont pas capables d'une nutrition autotrophe. Par conséquent, ils sont cultivés dans des conditions d'éclairage diffus ou dans l'obscurité. Les composants obligatoires des milieux de culture devraient être les auxines qui causent dédifférenciation explanter des cellules et des cytokinines qui induisent la division cellulaire. Lorsque le rapport entre ces phytohormones change ou lorsque d'autres phytohormones sont ajoutées, différents types de morphogenèse.
Facteurs physiques. La croissance et le développement des tissus végétaux in vitro sont fortement influencés par des facteurs physiques - lumière, température, aération, humidité. La plupart des tissus calleux peuvent se développer dans des conditions de faible luminosité ou d'obscurité, car ils sont incapables de faire la photosynthèse. Dans le même temps, la lumière peut agir comme un facteur de morphogenèse et d'activation des processus de synthèse secondaire. Pour la plupart des cultures de cals, la température optimale est de 26°C. Pour la culture des cultures en suspension, l'aération est d'une grande importance. Il est particulièrement important d'alimenter les cellules cultivées en air dans de grands volumes de fermenteurs. L'humidité optimale dans la pièce où poussent les cultures doit être de 60 à 70 %. Ainsi, la culture des cellules et des tissus dépend de nombreux facteurs environnementaux, et leur effet n'est pas toujours bien connu. Par conséquent, lors de l'introduction d'une nouvelle espèce végétale dans une culture, il est tout d'abord nécessaire d'étudier attentivement l'influence des facteurs physiques sur la croissance et les caractéristiques physiologiques de cette culture.
Date d'ajout : 2016-06-02 ; vues : 493 ;
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Processus de croissance cellules et tissus sur des milieux nutritifs artificiels dans des conditions stériles (in vitro) est appelée méthode d'obtention d'une culture de tissus isolés. La culture de tissus isolés est généralement cal et beaucoup moins souvent tissus tumoraux (fig. 3.1. et 3.2).
Cultures de cellules et de tissus isolés.
Utilisation d'une culture de cellules et de tissus isolés.
Les cultures de tissus isolés sont largement utilisées dans l'agriculture et la production industrielle. Ils possèdent avantages par rapport au matériel végétal traditionnel (plantes sauvages et de plantation), à savoir :
1. Indépendance des conditions extérieures.
2. Optimisation des conditions de croissance.
3. Automatisation et informatisation des processus.
4. La capacité de cultiver des espèces végétales menacées.
5. Possibilité de micropropagation clonale en masse de plantes fruitières et potagères et ornementales.
6. Récupération des infections virales et autres.
7. Opportunité à travers la culture in vitro, élargir les domaines de travail d'élevage, c'est-à-dire obtenir cloner cellules, puis des plantes aux propriétés programmées.
En raison de la capacité des cellules à synthétiser en culture métabolites secondaires, une nouvelle branche d'industrie est née, réalisant la synthèse biologique des substances nécessaires à l'homme.
Conditions pour la culture des tissus et des cellules.
Culture de fragments de tissus ou d'une plante - explants, et plus encore pour les cellules individuelles, nécessite une asepsie complète.
Les micro-organismes pouvant pénétrer dans le milieu de culture sécrètent toxinesinhibant la croissance des cellules et conduisant la culture à la mort. Par conséquent, toutes les manipulations avec les cellules et les tissus pendant la culture in vitro réalisée dans le respect de certaines règles d'asepsie en boîte laminaire ou dans des locaux aseptiques. L'asepsie est réalisée en fournissant de l'air stérile passé à travers les filtres, dirigé de la boîte laminaire vers l'extérieur. A la surface des tissus végétaux, il y a toujours microflore épiphyte. Par conséquent, la stérilisation de surface est nécessaire, ce qui est réalisé en traitant les zones de plantes dont ils vont isoler explants, désinfectants (peroxyde d'hydrogène, chlorure mercurique).
Pour travailler avec du matériel biologique, les composants suivants sont nécessaires :
- vaisselle propre et bioréacteur (fermenteur) ;
- milieu nutritif stérile ;
- éclairage optimal ;
- température optimale ;
- humidité optimale ;
- aération.
Nettoyer la vaisselle et le fermenteur. Les instruments et le coton préalablement emballés dans du papier ou du papier d'aluminium sont stérilisés à la chaleur sèche dans armoire de séchage à une température de 160 ° C pendant 1,5 à 2 heures.
Lors de l'utilisation de différents types de fermenteurs, il a été constaté que les propriétés physiologiques des cultures peuvent changer ; par conséquent, la synthèse des métabolites secondaires dans une culture en suspension doit être effectuée avec une alimentation en air par le bas. Dans ces conditions, la synthèse se déroule beaucoup plus activement (Fig. 3.3).
Lors de la culture de cellules en petits volumes, par exemple dans des flacons, une aération normale est obtenue avec une agitation constante de la suspension.
Média culturel... La culture de cellules et de tissus isolés a lieu en multicomposant milieux nutritifs... Ils peuvent différer considérablement dans leur composition, cependant, la composition de tous les médias comprend nécessairement une composante la Fondation, auxquels s'ajoutent les groupes de substances nécessaires aux plantes : macro et microéléments, glucides, vitamines et phytohormones. Une telle base de composants est l'agar-agar - un polysaccharide d'algue, capable de former des gels dans l'eau qui se solidifient à 45 ° C. Peut être ajouté au milieu de culture endosperme embryons immatures (coco, marronnier d'Inde), sirop quelques arbres, différents extraits (malt, levure), jus de tomate. Leur introduction dans l'environnement donne un résultat positif. Cependant, chaque composant actif possède des caractéristiques technologiques qui lui sont inhérentes.
Riz. 3.3. Bioréacteur (fermenteur) pour la croissance de micro-organismes, de cellules ou de tissus
La dédifférenciation est à la base du processus de formation du cal.
La dédifférenciation est le retour des cellules spécialisées à l'état méristématique lorsqu'elles acquièrent la capacité de se diviser.
Les organes et les tissus des plantes servent de matériau de départ pour obtenir des cultures de cellules et de tissus, cependant, les feuilles de plantes sont plus souvent utilisées pour cela.
Le fragment de feuille stérile préalablement travaillé est placé sur un milieu nutritif solide. Les feuilles sont constituées de différents tissus dont les cellules se différencient et synthétisent diverses molécules de protéines, glucides, lipides et autres substances caractéristiques de ces cellules. Ces cellules différenciées n'ont pas la capacité de se diviser.
Dans le processus de dommages mécaniques à la feuille l'explant est libéré, et sous l'influence d'hormones végétales ajoutées à l'environnement, auxines et cytokinines la cellule est dédifférenciée. Il perd des substances de stockage - amidon, protéines, lipides, organites spécialisés, chloroplastes, etc. En conséquence, toutes les cellules acquièrent de nouvelles propriétés morphologiques et physiologiques proches, c'est-à-dire deviennent des cellules calleuses (en division). Du tissu calleux se forme sur l'explant de feuille.
Types de cultures cellulaires. Selon la méthode et les conditions de culture, il existe plusieurs types de cultures cellulaires et tissulaires :
- la culture du cal ;
- culture en suspension ;
- culture monocellulaire.
Si cultivation arrive superficiellement sur le milieu nutritif gélosé, puis le tissu calleux est formé. Il n'a pas de structure claire, mais sa densité peut varier. L'origine et les conditions de croissance déterminent si le tissu calleux est lâche, de densité moyenne ou dense.
Caractéristiques générales des cellules calleuses. La cellule du cal a un certain nombre de propriétés en commun avec toutes les cellules végétales... Il s'agit de l'ontogénie des cellules, de la résistance à certains facteurs environnementaux défavorables et d'autres propriétés. Dans le même temps, au cours de leur culture, les cellules du cal acquièrent leurs propres caractéristiques individuelles, telles que l'asynchronie physiologique, l'hétérogénéité génétique et quelques autres.
Asynchronie physiologique réside dans le fait qu'à chaque instant les cellules sont dans des phases de croissance différentes : certaines se divisent, d'autres grandissent, d'autres encore vieillissent déjà. Par conséquent, le vieillissement physiologique général de l'ensemble de la population de cellules calleuses est généralement évalué par l'état de la plupart des cellules (Fig. 3.4).
Riz. 3.4. Cellules calleuses dansRiz. 3.5. Sortie du protoplaste par
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